تجزیه زیستی پلی‌آمید 6

1-مقدمه

با توسعه فناوری و افزایش جمعیت جهان، پلاستیک‌ها کاربردهای گسترده‌ای در صنعت پیدا کرده‌اند تا نیازهای روزمره ما را برطرف کنند. پلی‌آمید 6 (PA6) یکی از مهم‌ترین ترموپلاستیک‌های موجود در بازار است که بدلیل خواص مکانیکی، شیمیایی و حرارتی عالی خود بطور گسترده در صنعت استفاده می‌شود. این ماده بطور گسترده در اجزای مکانیکی ماشین آلات مانند یاتاقان‌ها، پیچ‌ها، چرخ‌ها، غلتک‌ها، قرقره‌ها، ورق‌های لاتون و صفحات متحرک برای ابزارهای ماشین‌آلات استفاده می‌شود. این ماده عمدتا برای ساخت الیاف و تورهای ماهیگیری استفاده می‌شود. تولید جهانی تمامی محصولات PA6 در سال 2016 حدود 4/4 میلیون تن بود (فرناندز، PMERG، 2018). بدلیل افزایش تقاضا برای این پلیمر در بازار و دفع شدید آن در محیط زیست، امروزه بعنوان یک آلاینده جهانی شناخته می‌شود. بسیاری از محصولات پلیمری و ضایعات آنها نهایتا سر از محیط‌های باز در می‌آورند که تهدیدی برای کره زمین هستند (داتووا و همکاران 2016). برای مثال، تورهای ماهیگیری از جنس PA6 می‌توانند تا 600 سال در دریا دوام بیاورند (اوبراهیم 2019) (مجله ماهیگیری اروپا 2021) که ریسک بالایی برای اکوسیستم و زندگی دریایی دارد. در مراکش، هرساله بیش از یک میلیون تن ضایعات پلاستیکی تولید می‌شود که حدود 60 درصد از آن در فضاهای عمومی دفع می‌شود، بیشتر آن بصورت کنترل نشده دفع می‌شود و 33 درصد آن نیز وارد حیات وحش می‌شود. یعنی از 70 هزار تن ضایعات پلاستیکی تولید شده فقط 7 درصد از آن بازیافت می‌شود (MC 2021). کیسه‌های پلاستیکی، بسته‌بندی‌های خوراکی، وسایل ماهیگیری، درب بطری، گوش پاک‌کن و غیره جزء بیشترین ضایعات پلاستیکی هستند که در محیط‌های دریایی گردآوری می‌شوند.

همانند بسیاری از پلیمرها، PA6 (شکل 1) نیز مقاومت بالایی نسبت به تجزیه در محیط طبیعی دارد و این زیست تجزیه‌پذیری پایین احتمالا بدلیل برهم‌کنش‌های قوی بین زنجیر مولکولی آن است که توسط پیوندهای هیدروژن بین زنجیرهای مولکولی PA6 و تقارن شدید ساختار آن ایجاد می‌شود (توکیوا و همکاران 2009).

شکل 1: ساختار پلی آمید 6

 

در حال حاضر شاهد افزایش توجه جهانی برای حل مسأله آلودگی پلاستیک‌ها هستیم به نحوی که راهکارهایی نظیر سوزاندن، بازیافت، دفن در محل‌های مخصوص و کمپوست کردن آنها ارائه شده است. سوزاندن ضایعات پلاستیکی معمولا گازهای سمی را آزاد می‌کند که به محیط زیست و سلامت انسان آسیب می‌رساند. بازیافت آنها از هدر رفتن منابع طبیعی و انرژی جلوگیری می‌کند و تأمین مواد خام صنعتی را تضمین می‌کند که باعث می‌شود راهکار مناسبی باشد. از طرف دیگر، فرایند بازیافت مواد چندلایه و چندجزئی بسیار پیچیده است چون جدا کردن مواد مختلف دشوار است. مکان‌های دفن زباله نیز شامل ذخیره کردن ضایعات خانگی غیرقابل بازیافت، ضایعات صنعتی ناشی از از بخش‌های تجاری و صنعتی و هم‌چنین پساب تصفیه خانه فاضلاب است. این کار در مکان‌های آب‌بندی شده و تحت شرایط کنترل شده انجام می‌شود تا تأثیر این ضایعات بر محیط زیست کنترل شود ولی شیرآبه و بیوگاز از آنها خارج می‌شود. این روش کاربردهای محدودی برای ضایعات غیرخطرناک دارد. کمپوست کردن نیز راهی برای تجزیه ضایعات پلاستیکی است ولی فقط برای پلاستیک‌های زیست تخریب‌پذیر قابل استفاده است. هم‌چنین تجزیه پلیمرها زمان زیادی می‌برد چون به میکروارگانیزم‌ها وابسته است که استفاده از این روش را محدود می‌کند (چوند سونال و همکاران 2013).

تجزیه زیستی یکی از راهکارهای ممکن برای حل این مسأله است و شامل استفاده از میکروارگانیزم‌هایی است که می‌توانند انواع مولکول‌های غیرآلی را از طریق متابولیزم تغییر دهند (آتا و همکاران 2017). در مقالات علمی، این حقیقت که تحقیقات زیادی درباره تجزیه زیستی پلاستیک‌ها با میکروارگانیزم‌ها انجام شده است نشان می‌دهد که این روش یک روش کارآمد برای بازیافت ضایعات پلاستیکی است (اسماعیلی و همکاران 2013، هو و همکاران 2017، یپ و همکاران 2020). این تحقیقات نشان می‌دهد که تجزیه زیستی یک پدیده کارآمد برای تخریب مولکولی اجزای سازنده این مواد توسط فرایند تفکیک یا تکه تکه شدن است که باعث اصلاح ساختار شیمیایی مواد پلاستیکی به کمک فعالیت بیولوژیکی آنزیم‌های تراوش شده از میکروارگانیزم‌ها با حمله به زنجیرهای ماکرومولکولی ماده و شکستن آنها به الیگومرها، دیمرها و مونومرهایی با وزن مولکولی پایین می‌شود. این فرایند باعث تولید محصولات متابولیتی و زیست تجزیه‌پذیر بصورت گاز (H2O, CO2)، زیست توده جدید یا بقایای زیستی می‌شود (جبیلو و همکاران 2011).

مواد پلیمری را می‌توان با روش‌هایی که به رشد میکروب‌ها متکی هستند بصورت بیولوژیکی تجزیه کرد. برای مثال روش ناحیه امن وجود دارد که برای تست‌های انجام شده روی یک محیط کشت آگار استفاده می‌شود به نحوی که پلیمر مورد نظر تنها منبع کربن و نیتروژن در محیط کشت است و روی سطح بصورت یک لایه نازک انباشته می‌شود (کالمن دکریود و همکاران 1998) یا بصورت پودر به آگار افزوده می‌شود (توکیوا و کالابیا 2006). پس از تلقیح با ماده شناور روی سطح، رشد سویه‌ها با قدرت تجزیه پلیمر باعث ایجاد یک ناحیه امن می‌شود. هم‌چنین روش حمله میکروارگانیزم‌ها به پلیمر نیز وجود دارد که به حساسیت مواد پلیمری به تهاجم میکروبی بستگی دارد. در این روش، لایه نازک پلاستیکی روی سطح یک محیط کشت آگار قرار داده می‌شود و میزان تجزیه زیستی بصورت مشاهده مستقیم مواد مورد تهاجم قرار گرفته توسط میکروارگانیزم‌ها تخمین زده می‌شود (جبیلو و همکاران 2011). تحقیقات حاکی از پتانسیل برخی باکتری‌ها نظیر فلاووباکتریوم اسفریکوس (کینوشیتا و همکاران 1975) و سودوموناس اسفریکوس (NK87) (کاناگاوا و همکاران 1989) برای تجزیه الیگومرهای PA6 است ولی آنها نمی‌توانند نایلون 6 را تجزیه کنند. این در حالیست که آنوکسی باسیلوس روپینسیس Ir3 (مهدی و همکاران 2016)، باسیلوس اسفریکوس (دمیرخان و همکاران 2020) و سودوموناس اروژینوزا (HE858284) (سانوت و همکاران 2015) قادر هستند نایلون 6 را تجزیه کنند. علاوه بر این، برخی از سویه‌های قارچ‌ پوسیدگی سفید (دگوچی و همکاران 1998) و تانلا مپنسیس WT-6 نیز قادر بودند نایلون 6.6 را تجزیه کنند (ژو و همکاران 2021).

این پژوهش روی ایزوله کردن و شناسایی باکتری‌های جمع شده از محل دفن پسماندهای جامد تمرکز دارد تا پتانسیل آنها برای تجزیه PA6 توسط انکوباسیون قرص‌های PA6 با 38 سویه باکتریایی در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بمدت 48 روز را بررسی کنیم. روش‌های تحلیلی برای اطمینان از تجزیه زیستی PA6 با نظارت بر سینتیک رشد باکتری توسط دستگاه طیف سنج انجام شدند. شناسایی سویه‌های باکتریایی نیز با استفاده از روش 16S rRNA انجام شد. تأیید تجزیه زیستی نیز با میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) انجام شد تا کلنی‌سازی و حفرات ظاهر شده روی سطح پلیمر به همراه تجزیه احتمالی سطح ماده مشخص شود. آنالیزهای کیفی و کمی نیز به ترتیب با طیف‌سنج FTIR و اندازه‌گیری اتلاف وزن ماده انجام شدند.

2-مواد و روش‌ها

1-2 سنتز PA6

معرف‌های شیمیایی ε-کاپرولاکتام، N-استیل‌کاپرولاکتام و NaH از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شدند. این مواد بدون خالص‌سازی اولیه استفاده شدند. سنتز PA6 با جزئیات کامل در مقاله اولیدی و همکارانش (2022) آورده شده است. PA6 سنتز شده دارای وزن مولکولی g/mol 27000 و چگالی 14/1 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد بود که آسیاب شده و با استفاده از یک دستگاه پرس هیدرولیک ICL (آزمایشگاه‌های بین‌المللی کریستال‌سازی) 20 تنی بصورت قرص درآمد. قرص‌ها به شکل ورق‌هایی به قطر 13 میلی‌متر و ضخامت تقریبی 1 میلی‌متر بودند که توسط یک کولیس HOLEX اندازه‌گیری شدند.

2-2 ایزوله کردن باکتری

 مواد پلاستیکی فرسوده از محل دفن زباله‌ها در شهر مکناس با مختصات ″42 ′53 °33  شمال و ″17 ′33 °5  غربی مراکش و حین ماه آوریل (متوسط دمای 20 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 78 درصد) جمع‌آوری شدند. این پلاستیک‌ها در کیسه‌های استریل جمع‌آوری شدند و سپس به آزمایشگاه میکروبیولوژی واقع در دانشکده علوم مکناس فرستاده شدند. سویه‌های باکتریایی از این پلاستیک‌ها جمع‌آوری شدند و با استفاده از محیط کشت گزینشی جدا شدند تا تفکیک شوند. سپس این محیط‌های باکتریایی ایزوله در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. تلقیح باکتری‌ها قبل از استفاده در فرایند تجزیه درون یک محیط کشت جامد روی آگار مغذی و سپس انکوباسیون آن در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بمدت 24 ساعت انجام شد.

3-2 استریل کردن نمونه‌ها

قرص‌های PA6 قبل از تلقیح درون محیط کشت مورد نظر استریل شدند که این کار با استفاده از یک اتوکلاو در دمای 120 درجه سانتی‌گراد بمدت 10 دقیقه انجام شد. پس از فرایند استریل کردن شاهد هیچ گونه تغییر شکل قرص‌ها نبودیم.

4-2 محیط کشت و انکوباسیون

ترکیبات و مقادیر استفاده شده از محیط کمینه (MM) (تاچیبانا و همکاران 2010) که برای این پژوهش انتخاب شده‌اند در جدول زیر آورده شده‌اند. محیط کشت حاوی ترکیبات پایه و محیط کشت حاوی ترکیبات خاص به ترتیب در 1 لیتر و 300 میلی‌لیتر آب مقطر تهیه شدند و سپس این دو محیط با هم ترکیب شدند تا محیط MM استفاده شده در این پژوهش بدست آید. بطور خلاصه، 25 میلی‌لیتر از محیط کمینه به درون لوله‌های آزمایش ریخته می‌شود و با کمک یک دستگیره، کسری از هر 38 باکتری به درون هر لوله آزمایش اضافه می‌شود. همگن بودن مخلوط با کمک گردابه‌ها تضمین می‌شود. سپس قرص‌های PA6 با دقت درون هر لوله غوطه‌ور می‌شود و بمدت 48 روز تحت دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون می‌شوند.

5-2 روش‌های شناسایی

1-5-2 شناسایی مولکولی سویه‌های باکتریایی

این کار با استفاده از روش 16S rRNA در مرکز ملی علوم و تحقیقات (CNRST) و توسط تیم UATRS در شهر رباط انجام شد.

2-5-2 فیلوژنی یا تبارزایی

الکتروفروگرام‌های توالی 16S rRNA سویه‌های باکتری با استفاده از محیط کار ژنومی CLC 10.1.1 آنالیز شد. درصد تشابه بین توالی‌ سویه‌های ایزوله شده و آنهایی که قبلا در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI منتشر شده بودند) با استفاده از برنامه جستجوی BLASTn مشخص شد. آنالیز فیلوژنتیک با استفاده از نرم‌افزار MEGA 11 (کومار و همکاران 2016) انجام شد. توالی‌های 16S rRNA با استفاده از Clustal W تنظیم شدند. تاریخچه تکاملی با استفاده از روش UPGMA مشخص شد (اسنیت و سوکال 1973). فاصله‌های تکاملی با استفاده از روش احتمال ماکزیمم ترکیبی (تامورا و همکاران 2004) محاسبه شدند و برحسب تعداد جانشینی‌های پایه به ازای سایت بیان شدند. این آنالیز شامل 16 توالی نوکلئوتید است.

3-5-2 چگالی نوری (OD)

سینتیک رشد باکتری با اندازه‌گیری کدری (چگالی نوری) محیط کشت باکتریایی با استفاده از طیف‌سنج SELECTA V-1100D در طول موج 0.5 ± 600 nm تعیین شد (سانوت 2012، مهدی و همکاران 2016).

4-5-2 اندازه‌گیری اتلاف وزن قرص‌های PA6

قرص‌های PA6 توسط روش‌های متداول فیلتراسیون از محیط انکوباسیون بازیابی شدند. زیست لایه که روی ذرات پلاستیک کلنی‌سازی کرده بود با شستشوی آب حذف شد و سپس قرص‌ها در آون هوای داغ 50 درجه بمدت 6 ساعت خشک شدند.

5-5-2 اندازه‌گیری نرخ کاهش وزن پلیمر

نتایج اتلاف وزن پلیمر بررسی شد تا نرخ کاهش وزن PA6 با استفاده از مدل سینتیکی مرتبه اول و بر اساس وزن اولیه و نهایی نمونه در بازه‌های زمانی خاص (10 روز) مشخص شود.

6-5-2  طیف‌سنج FTIR

وزن خاصی از نمونه‌های تجزیه شده بصورت زیستی با کریستال‌های KBr آسیاب شد و سپس به یک قرص خاص برای انجام آنالیز IR فشرده شد. دستگاه استفاده شده در اینجا یک طیف‌سنج تبدیل فوریه Jasco 4100 است. آنالیز طیف‌های جذب در طول موج‌های cm-1 400-4000 انجام شد.

7-5-2 میکروسکوپ الکترونی روبشی

مورفولوژی و نقشه عنصری نمونه‌ها با استفاده از یک میکروسکوپ الکترونی روبشی JEOL JSM-IT 500 HR مجهز به اسکن آشکارساز عنصری (EDS) بررسی شد که این دستگاه در ولتاژ شتاب دهنده 3kV و در حالت تصویربرداری الکترون ثانویه کار می‌کرد. قرص‌ها بصورت جداگانه با یک چسب دوطرفه به هولدر دستگاه چسبانده شدند. این آنالیز در مرکز فناوری و نوآوری دانشگاه ملا اسماعیل (CITT-UMI) در شهر مکناس مراکش انجام شد.

3- نتیجه‌گیری

این پژوهش پتانسیل استفاده از باکتری‌های لیسینی باسیلوس اسفریکوس (MH717277.1)، آلکالیژنس فکالیس (KM222194.1) و انتروکوکوس فکالیس (KR137541.1) ایزوله شده از مکان‌های عمومی دفن زباله در شهر مکناس مراکش را برای تجزیه PA6 مصنوعی بررسی کرد. این پژوهش با هدف پرکردن شکاف تحقیقاتی موجود برای بررسی باکتری‌هایی که می‌توانند پلاستیک‌ها خصوصا PA6 را تجزیه کنند انجام شد. آنالیز کمی انجام شده توسط اندازه‌گیری اتلاف وزن، نرخ کاهش وزن و آنالیز عنصری (EDS) نشان داد که لیسینی باسیلوس اسفریکوس و آلکالیژنس فکالیس اتلاف وزن و نرخ کاهش وزن قابل توجهی را ثبت کردند که کاهش مقدار کربن و نیتروژن آزاد شده نیز آن را تأیید کرد. نتایج بدست آمده از قرص‌های انکوباسیون شده با انتروکوکوس فکالیس نشان دهنده مقادیر جالبی بود ولی نتایج آن قابل مقایسه با سایر سویه‌ها نیست. این موضوع را می‌توان با انتخاب انتروکوکوس فکالیس توجیه کرد که نیتروژن بیشتری را مصرف می‌کند که کمتر در ساختار PA6 وجود دارد.

از لحاظ کمی نیز جنبه‌های بصری قرص‌های PA6 نشان دهنده تجزیه بیولوژیکی آنها بود که تیره‌تر و شکننده‌تر شدن باکتری‌های لیسینی باسیلوس اسفریکوس و آلکالیژنس فکالیس نیز آن را تأیید کرد. در مورد باکتری‌های انتروکوکوس فکالیس نیز قرص‌های کمتر از دو سویه دیگر تجزیه شده بودند و یک لایه زیستی سفید رنگ نیز در ماده شناور روی سطح تجزیه شده با لیسینی باسیلوس اسفریکوس و انتروکوکوس فکالیس مشاهده شد. اندازه‌گیری چگالی نوری نیز رشد این سه باکتری را تأیید کرد. آنالیز ساختاری نمونه‌ها با طیف‌سنج FTIR نیز نشان‌دهنده کاهش شدت پیوندهای N-H، C-H و C=O و افزایش شدت پیک‌های C-C برای لیسینی باسیلوس اسفریکوس و آلکالیژنس فکالیس بود که این نتایج برای انتروکوکوس فکالیس واضح‌تر بود. تصاویر SEM نیز وجود حفرات و گودی‌ها روی سطح قرص‌ها را در هر سه باکتری نشان داد. بنابراین می‌توان گفت که این سه سویه باکتریایی با موفقیت PA6 را تجزیه کرده‌اند ولی لیسینی باسیلوس اسفریکوس و آلکالیژنس فکالیس از لحاظ کمی PA6 بیشتری را تجزیه کرده بودند.

بعنوان پیشنهاد برای آینده نیز می‌توان PA6 را با الیاف بافته شده (ردیفی) سنتز کرد تا تجزیه زیستی آن تسریع یابد.

 

منبع مقاله

دیدگاه خود را بیان کنید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.