بلاگ

سیستم‌های پلیمری مدولار: روشی جدید برای درمان سرطان سر و گردن

مقدمه

سرطان سر و گردن ششمین سرطان رایج در جهان است به نحوی که هرساله بیش از 70 هزار بیمار در ایالات متحده آمریکا به این سرطان مبتلا می‌شوند. در 30 سال اخیر و علی‌رغم پیشرفت‌های قابل توجه در روش‌های جراحی، پرتودرمانی، شیمی درمانی و استفاده ترکیبی از این روش‌ها، نرخ زنده ماندن بیماران درگیر با کارسینوم سلول‌های سنگ‌فرشی سروگردن (HNSCC) بین 3 تا 5 سال است. حدودا 50 درصد از بیماران از این بیماری جان سالم به در نمی‌برند و روش‌های درمانی روی آنها جواب نمی‌دهد، به همین دلیل بازگشت سلول‌های سرطانی در این بیماران بسیار رایج است. اگرچه شیمی درمانی بعنوان یک روش تسکین دهنده استفاده می‌شود، سمیت سیستمی و تأثیر آن روی کیفیت زندگی بیمار باعث می‌شود تا کاربرد بالینی آن محدود شود. روش‌های درمانی که از دوز کمتری از دارو استفاده می‌کنند تا آسیب کمتری به بافت‌های سالم وارد شود و در عین حال از گسترش تومور جلوگیری می‌کنند باعث افزایش شانس زنده ماندن بیمار می‌شوند.

در این پژوهش از یک روش ترکیبی یعنی یک پلیمر دولایه استفاده کردیم که در آن از CaCO₃ برای تسهیل فرایند پرتودرمانی به کمک تصویربرداری (RT) و تیموکینون (TQ) بعنوان یک عامل داروئی حساس به پرتودرمانی برای بهبود فرایند RT استفاده شد. کلسیم کربنات یک ماده بی‌اثر است که به راحتی در تصویربرداری مقطعی قابل تشخیص است. هم‌چنین این ماده ارزان‌ است و تولید صنعتی آن در مقایسه با سایر فلزات پر اتم مانند نانوذرات طلا راحت‌تر است. حین عمل، جراحان به راحتی می‌توانند بفهمند تومور در چه ناحیه‌ای از بدن چسبیده است و در چه قسمتی به راحتی جدا شده است. حین عمل جراحی، جراح می‌تواند این پلیمر را در نواحی نزدیک به تومور چسبیده به بدن قرار دهد و پرتودرمانی را دقیق‌تر انجام دهد. موقعیت‌یابی این پلیمر به کمک تصویربرداری باعث می‌شود تا بیماران از روش درمان دقیقی بهره ببرند و اثرات جانبی پرتودرمانی حداقل شود. تیموکینون (TQ) یک محصول طبیعی است که از روغن سیاه دانه بدست می‌آید و خواص ضدسرطانی دارد در حالی که از لحاظ بیولوژیکی نیز قابل تحمل است. در یک مدل حیوانی زنوگرافت از کارسینوم سلول‌های سنگ‌فرشی سروگردن، این پلیمر دولایه CaCO₃/TQ باعث کاهش شدید حجم تومور شد و راه را برای موقعیت‌یابی دقیق بافت‌های سرطانی و تنظیم فرایند RT هموار کرد.

روش‌هاکشت سلول: سلول‌های سرطان سروگردن از شرکت ATCC خریداری شدند و کارسینوم سلول‌های سنگ‌فرشی گرفته شده از موش (SCCVIISF) نیز از یک تومور پخش شده در موش گرفته و سپس کشت داده شد. تمامی این رده‌های سلولی در شرایط زیر کشت داده شدند: دمای 37 درجه سانتی‌گراد، انکوباتور حاوی 5 درصد CO₂ با محیط کشت اصلاح شده عقاب (DMEM)، 10 درصد سروم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد

پنی‌سیلین/استرپتومایسین. این محیط کشت دوبار در هفته تعویض شد تا زمانی که سلول‌ها روی هم بیفتند. سپس این سلول‌های درهم تنیده برای استفاده برداشت شدند.

سنتز فیلم‌های چندلایه: پلی(D،L-لاکتید-co-گلیسولید) (PLGA, 50:50, Mn 25000)، پلی‌وینیل الکل (PVA، MW:31000-50000) و دی‌کلرومتان (DCM) از شرکت سیگما-آلدریچ (سانتا باربارا، USA) خریداری شدند. محلول بافر فسفات (pH 7.4) از شرکت Gibco Life Technologies (AG، سوئیس) تهیه شد. تمامی ترکیبات شیمیایی استفاده شده در این پژوهش دارای خلوص آزمایشگاهی بودند و بدون خالص‌سازی دوباره استفاده شدند. فیلم‌های چندلایه بصورت لایه به لایه تهیه شدند و ساخت هر لایه به پارامترهای مختلف ماده مانند سفت بودن، چقرمگی، چسبندگی، تجزیه‌پذیری، تخلخل، آبدوستی و ظرفیت بارگذاری بستگی داشت. یک روش ساخت لایه‌ها شامل استفاده از یک ماشین نخ ریسی مکانیکی و بدنبال آن گرمایش و تبخیر حلال بود. ابتدا 10 گرم از پودر PVA به 100 میلی‌لیتر آب دیونیزه شده اضافه شد و سپس بمدت 1 ساعت در دمای 95 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد تا یک محلول 10% (w/v) PVA بدست آید. سپس 4/0 گرم از میکروذرات کلسیم کربنات (CaCO₃) بمدت 5 دقیقه درون حمام التراسونیک قرار داده شد و متعاقبا درون 10 میلی‌لیتر از محلول PVA حل شد و مخلوط حاصل بمدت 2 دقیقه همزده شد (شکل 1).

شکل 1: درمان با داروی TQ باعث کاهش بقای سلول‌های سرطانی شده است. (A) آزمایش‌های تعیین دوز بهینه با استفاده از یک رده سلولی از بافت‌های سرطان سروگردن انسان و سلول‌های SCCVIISF موش نشان داد که μM 15 از TQ برای کاهش تشکیل کلنی تا 50 درصد مفید است (P<0.001). (B) منحنی خطی و درجه دوم بقای سلول که سلول SCCVIISF درمان شده با TQ را در مقایسه با سلول کنترل نشان می‌دهد. TQ با پرتودرمانی اثر هم‌افزایی دارد که باعث کاهش شدید بقای سلول‌های سرطانی در Gy 8 با p<0.05 و با 4/86 درصد (SD 2.7%) حین استفاده از RT به تنهایی و 1/2 درصد (SD 0.6%) حین استفاده ترکیبی از RT با μM TQ10 می‌شود.

محلول همگن حاصل به درون یک پتری‌دیش پلاستیکی ریخته شد و درون یک همزن قرار داده شد تا بصورت یکنواخت پخش شود. در مرحله بعد، پتری‌دیش بمدت 2 ساعت درون یک آون با دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد تا مطمئن شویم آب موجود در آن بطور کامل تبخیر شده است. نهایتا اولین لایه (CaCO₃/PVA) برای تصویربرداری CT بدست آمد. علاوه بر این، 0/5 گرم از پودر PLGA به 10 میلی‌لیتر از محلول DCM افزوده شد و سپس بمدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد تا محلول 5 درصد (w/v) PLGA بدست آید. سپس 20 میلی‌گرم از پودر TQ بمدت 5 دقیقه التراسونیک شد و سپس به 2 میلی‌لیتر از محلول PLGA افزوده شد و مخلوط حاصل بمدت 2 دقیقه همزده شد. مخلوط حاصل بصورت قطره به قطره به لایه اول در پتری‌دیش اضافه شد و سپس در هوای محیط و تحت تهویه مناسب بمدت 30 دقیقه تبخیر شد. این فیلم پلیمری چندلایه با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی تصویربرداری شد (شکل 2).

شکل 2: شناسایی میکروذرات CaCO₃ و فیلم‌های CaCO₃/PVA و سینتیک آزادسازی دارو. (A) تصویر SEM گرفته شده از میکروذرات CaCO₃ (مقیاس شکل: 50 میکرومتر)، (B)  تصویر میکروسکوپی از فیلم CaCO₃/PVA (مقیاس شکل: 50 میکرومتر)، (C) فیلم‌های CaCO₃/PVA با غلظت‌های مختلف از CaCO₃ (1، 0/5، 0/2، 0 و 2 درصد وزنی)، (D) بررسی آزادسازی داروی ضدسرطانی در بدن (خط سیاه) در حالی که نقطه قرمز بیانگر داروی آزاد شده به محض جراحی پایانی روی موش است.

تست‌های کشش روی این فیلم انجام شدند که نتایج آنها در شکل 3 آورده شده است.

شکل 3: شناسایی پلیمر چندلایه ساخته شده. (A) تصویر SEM از برش عرضی پلیمر چندلایه (مقیاس شکل: 50 میکرومتر)، (B) و (C) تصاویر SEM از سطح لایه CaCO₃/PVA و TQ/PLGA بر روی این پلیمر (مقیاس شکل: 5 میکرومتر). در شکل (D)، عملکرد مکانیکی این پلیمر چندلایه بصورت کرنش کششی برحسب تنش کششی رسم شده است. مقاومت کششی این پلیمر با استفاده از آنالیز مکانیکی دینامیکی محاسبه شد؛ این فیلم پلیمری دارای مقاومت کششی بسیار بالا (MPa 32/9) است که برای کاربردهای بالینی مناسب است.

نهایتا فیلم‌های چندلایه با لایه اول (CaCO₃/PVA) برای تصویربرداری CT و لایه دوم (TQ/PLGA) برای شیمی درمانی بدست آمدند (شکل 4).

شکل 4: تصویربرداری CT از نمونه که موقعیت پلیمر در تومور را برای پرتودرمانی دقیق مشخص می‌کند.

پروتکل جراحی موش: در این پژوهش از موش نر C3H/HeJ (آزمایشگاه جکسون، ایالت ME، آمریکا) و طبق پروتکل شماره 2008-147 انجمن تحقیق روی حیوانات (ARC) استفاده شد. هم‌چنین دستورالعمل‌ها و پروتکل‌های مورد تأیید انجمن تحقیق روی حیوانات در دانشگاه کالیفرنیا و ضوابط ارائه شده در آزمایش‌های درون تنی روی حیوانات (ARRIVE) بکار گرفته شدند. برای تست این سیستم پلیمری ساخته شده، 20 موش C3H/HeJ هشت هفته‌ای با 400 هزار سلول سنگ‌فرشی سروگردن بدست آمده از موش (SCCVIISF) تزریق شدند که این سلول‌های سرطانی به پهلوی راست آنها تزریق شد. رشد تومور سه بار در هفته و پس از قرار دادن پلیمر دولایه بمدت 18 تا 31 روز با کولیس اندازه‌گیری شد تا راندمان ضد تومور این روش درمانی مشخص شود. بدلیل بار مسئولیتی استفاده از سلول‌های سرطانی، موش‌ها بر اساس دستورالعمل انجمن تحقیق روی حیوانات در دانشگاه کالیفرنیا و انجمن پزشکی دامپزشکی آمریکا (AVMA) بیهوش شدند. طول، عرض و ارتفاع (mm) تومورها اندازه‌گیری شدند و حجم تومور (cm³) بر اساس فرمول طول×عرض×ارتفاع× π/6 بدست آمد. زمانی که میانگین اندازه تومورها به 0/5 تا 1 سانتی‌متر رسید، تمامی موش‌ها جراحی شدند تا 50 درصد از حجم تومور کاهش یابد. این کار برای شبیه‌سازی شرایط جراحی انجام شد که در آن بخشی از تومور قابل برداشته شدن نیست و قبل از درمان آن با پلیمر فوق نیز کمی از تومور در بدن باقی می‌ماند. سپس موش‌های بصورت رندوم به گروه‌های درمانی مختلف تقسیم شدند. این گروه‌های درمانی عبارتند از: پلیمر بی‌اثر بدون استفاده از دارو، پلیمر TQ, پلیمر بی‌اثر 4 × 3 Gy RTو پلیمر 4 × 3 TQ+ Gy RT. هیچ درمان سیستمی TQ انجام نشد. هر تومور با 2/25 سانتی‌متر مربع از برش پلیمر به شکل تومور باقی‌مانده پوشانده شد. پلیمر استفاده شده روی لبه‌های تومور قرار داده شد و بخیه شد.

پرتودرمانی: موش‌های گروه RT با کتامین/زایلازین بیهوش شدند و پس از گذشت 1، 2 و 3 روز از جراحی، پماد مخصوص چشم به آنها مالیده شد تا درمان RT بهتر انجام شود. موش‌ها در زیر یک ورق سرب به ضخامت نیم اینچ قرار داده شدند تا فقط تومور مشخص باشد. یک دوز پرتو ایکس در Gy/min 0/4229 بمدت 9/3 دقیقه اعمال شد تا زمانی که دوز کل آن به 4 Gy برسد. موش‌ها 4 ×3 Gy RT دریافت کردند که معادل دوز داده شده به بیماران درگیر با سرطان سروگردن است.

تصویربرداری MicroPET: تصویربرداری از موش‌های کوچک در مرکز تصویربرداری پیش بالینی موسسه Crump انجام شد. یک ردیاب رادیواکتیو (70μCi برای 18F-FDG و 400-200 μCi برای 11C-L-glutamine) از طریق رگ کنار دم موش‌ها تزریق شد و سپس بمدت 60 دقیقه در زیر داروی بیهوشی ایزوفلوران (2%) قرار گرفتند و پس از آن تصویربرداری MicroPET (G8 PET/CT، شرکت PerkinElmer) و MircroCT (CrumpCAT، آزمایشگاه Arion Hadjioannou) روی آنها صورت گرفت. کمی‌سازی مقدار جذب 18F-FDG با استفاده از نرم‌افزار AMIDE و با رسم ناحیه مورد نظر دور تومور و کل بدن و محاسبه هر ماکزیمم مقدار جذب (SUV_max) بصورت درصد دوز تزریق شده بر گرم (%ID/g) انجام شد.

نمونه‌برداری از بافت: پس از قربانی کردن موش‌ها، کالبدشکافی بافت‌های سرطانی انجام شد. هیچ تفاوت فاحشی در محل تزریق پلیمر بین گروه‌ها مشاهده نشد. گونه‌های تومور برای تشریح نمونه‌برداری شدند و رنگ‌آمیزی آنها با هموتوکسین و ائوزین در آزمایشگاه پاتولوژی دانشگاه UCLA انجام شد. بررسی هیستوپاتولوژیک نمونه‌ها نیز به کمک آسیب‌شناس ارشد مرکز پزشکی UCLA انجام شد.

برآورد سرعت آزاد شدن دوز TQ: پلیمرهای جاسازی شده قبل از کاشت در بدن وزن شدند. لایه مخصوص تصویربرداری (CaCO₃) و لایه حاوی دارو (TQ) از هم جدا شدند و بصورت جداگانه وزن شدند چون لایه تصویربرداری به نحوی ساخته شده است که سه ماه دوام بیاورد در حالی که لایه حاوی دارو 1 تا 1/5 ماه دوام می‌آورد. با کسر کردن وزن لایه‌ها قبل و بعد از گذشت یک ماه از کاشت پلیمر فهمیدیم که لایه تصویربرداری حدود 5% از وزن اولیه خود را از دست داده است ولی لایه حاوی دارو بالغ بر 60% از وزن اولیه خود را از دست داده است که معادل آزاد شدن 0/77 میلی‌گرم دارو بر روز یا uM/uM³ 4/68 است.

آمار: معناداری آماری در P = 0.05 تنظیم شده بود. برای آزمایش تعیین دوز بهینه TQ نیز لازم بود LD50 را بین 8 رده سلولی بدست آوریم که از طریق یک رگرسیون غیرخطی و برآزش شده و آزمون t یک نمونه‌ای بدست آمده بود. مقایسه حجم تومور در بین گروه‌های درمانی نیز با استفاده از یک آنالیز یک طرفه از مدل واریانس انجام شد. علاوه بر این، یک آزمون t دو نمونه‌ای و جفت نشده برای بدست آوردن اختلاف معناداری آماری بین گروه کنترل و سایر گروه‌های درمانی استفاده شد. یک منحنی بقای خطی و درجه دوم توسط نرم‌افزار GraphPad Prism رسم شد که در آن سلول‌های SCCVIISF درمان شده با TQ در مقایسه با سلول‌های کنترل رسم شده است.

نتیجه‌گیری

مدیریت بیماران درگیر سرطان سروگردن یک چالش مهم برای جراح و توده‌شناس است. در این مقاله یک فیلم پلیمری جدید و دولایه را معرفی کردیم که قادر است داروهای ضدتومور با قابلیت کشتن مقادیر قابل توجهی از سلول‌های سرطانی را آزاد کند. این لایه پلیمری در حین جراحی و پس از برداشتن یا کاهش حجم تومور سرطانی در بدن کاشته می‌شود تا پرتودرمانی پس از عمل بهبود یابد و هم‌چنین بعنوان یک سیستم برای آزادسازی داروهای ضدسرطانی و تعدیل کننده سیستم ایمنی عمل کند. بجز داشتن ویژگی‌های بالینی مرتبط، ماهیت مدولار این سیستم پلیمری باعث ایجاد یک روش مناسب برای تحقیقات بعدی می‌شود که به ما اجازه می‌دهد تا اهداف مولکولی خاص را دنبال کنیم. این سیستم پلیمری می‌تواند سلول‌های سرطانی در بدن بیمار را هدف قرار دهد چون می‌توانیم تومورها را مشخص کنیم و سپس بصورت گزینشی آنها را مورد هدف قرار دهیم. با پیشرفت سیستم‌های ترکیبی از این پلیمرها، استفاده مستقیم پلیمرها می‌تواند نقش مهمی در درمان سرطان سروگردن، سایر سرطان‌ها و بسیاری از بیماری‌های دیگر داشته باشد.

منبع مقاله