بلاگ

تأثیر نانوذرات پلی (استایرن-اکریلیک اسید) لاتکس بر سرطان

تأثیر نانوذرات پلی (استایرن-اکریلیک اسید) لاتکس روی سلول‌های سرطان روده بزرگ و دهانه رحم

مقدمه

مهم‌ترین ویژگی تومورهای بدخیم این است که سلول‌های آن بطور پیوسته و کنترل نشده رشد می‌کنند. انواع روش‌های درمانی مانند پرتودرمانی، شیمی درمانی، درمان هدفمند و جراحی برای بالا بردن شانس زنده ماندن بیمار و کیفیت بهتر زندگی او استفاده می‌شوند. سرطان هم‌چنان بعنوان اولین عامل مرگ و میر در جهان شناخته می‌شود. سرطان روده بزرگ و دهانه رحم شایع‌ترین سرطان‌های شناسایی شده هستند. سرطان روده بزرگ دومین سرطان کشنده در جهان شناخته می‌شود. علی‌رغم پیشرفت‌های زیاد برای درمان این بیماری، تقریبا 86 درصد از بیماران درگیر با سرطان روده بزرگ که تومور سرطانی در بدن آنها پخش شده است در بازه زمانی 5 ساله پس از تشخیص این سرطان می‌میرند. از طرف دیگر، سرطان دهانه رحم سومین سرطان رایج است که پس از سرطان سینه و روده بزرگ روی زنان در سراسر جهان اثر می‌گذارد و یکی از دلایل اصلی مرگ زنان بدلیل بیماری‌های مربوط به آنها است. تا امروز، مقاومت چنددارویی (MDR) بعنوان یکی از اصلی‌ترین چالش‌ها در شیمی درمانی بالینی و ضدتومور شناخته می‌شود. علاوه بر این، دارورسانی هدفمند داروهای شیمی درمانی به قسمت‌های خاص از بدن بیمار یکی از اصلی‌ترین چالش‌ها در روش‌های موجود برای درمان سرطان است چون فقط تعداد اندکی از داروهای شیمی درمانی ممکن است به این نقاط برسند.

از این رو، توسعه و طراحی استراتژی‌های درمانی جدید برای غلبه بر این چالش‌ها به یک نیاز فوری تبدیل شده است. انواع سیستم‌های دارورسانی در ابعاد نانو برای دارورسانی سیستمی داروهای انحلال‌ناپذیر مانند میکروامولسیون‌ها، مایسل‌ها، نانوذرات لیپیدی، نانوذرات پلیمری و لیپوزوم وجود دارند. از بین این سیستم‌ها، نانوذرات پلیمری یک حامل دارویی ایده‌آل برای داروهای ضد سرطانی هستند. مهم‌ترین مزیت استفاده از این نانوذرات مربوط به سازگاری زیستی خوب آنها و قابلیت آزادسازی پایدار دارو در نقطه مورد نظر است.

نانوذرات پلیمری یک گزینه مناسب برای درمان سرطان هستند چون می‌توانند هر دو داروهای آبدوست و آبگریز را در خود جا دهند و بدلیل کاربرد احتمالی بعنوان سیستم دارورسانی مانند پلی(استایرن-اکریلیک اسید) لاتکس توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند. استایرن بدلیل خواص شیمیایی منحصربفرد خود نظیر آبگریز، نیمه شفاف و ارزان بودن معمولا بصورت کوپلیمریزاسیون استفاده می‌شود. هم‌چنین، اکریلیک اسید پیوندهای دوگانه شدیدا فعالی دارد که خواص مهمی نظیر پایداری و قطبیت بالا در محلول‌های آبی را برای کوپلیمریزاسیون ایجاد می‌کند چون سطح این کوپلیمر دارای گروه‌های کربوکسیلیک و خاصیت آبدوستی است. فرایند پلیمریزاسیون امولسیونی یک روش مناسب برای تولید نانوذرات پلیمری است. این فرایند شامل امولسیون‌سازی مونومرهای آبگریز توسط یک عامل امولسیون‌ساز چربی در آب و سپس شروع واکنش با یک آغازگر محلول در آب (مانند پتاسیم پرسولفات (K₂S₂O₈)) است. لاتکس فوتوکرومیک حاوی 1⁰-(2-اکریل‌اکسی‌اتیل)-فرایند پلیمریزاسیون امولسیونی یک روش مناسب برای تولید نانوذرات پلیمری است. این فرایند شامل امولسیون‌سازی مونومرهای آبگریز توسط یک عامل امولسیون‌ساز چربی در آب و سپس شروع واکنش با یک آغازگر محلول در آب (مانند پتاسیم پرسولفات (K₂S₂O₈)) است.

لاتکس فوتوکرومیک حاوی1⁰(2اکریل‌اکسی‌اتیل)-3⁰3⁰-دی‌متیل-6-نیترواسپیرو-(2-H-بنزوپیران-2،2⁰-ایندولین (اسپیروپیران اتیل اکریلات) فعالیت نوری شدیدی را در زیر نور UV نشان می‌دهد. نانوذرات لاتکس پلی‌اسپیروپیران متاکریلات که با استفاده از پلیمریزاسیون امولسیونی به واسطه انتقال زنجیر افزایشی-جدایشی برگشت‌پذیر ساخته می‌شوند دارای خاصیت تحریک‌پذیری برگشت‌پذیر هستند. اسپیروپان با داشتن خاصیت فوتوکرومیک با پلیمر برهم‌کنش ایجاد می‌کند و به pH/نور عکس‌العمل نشان می‌دهد. نانولاتکس کوپلیمری بر اساس پلی (متیل متاکریلات-co-N-وینیل کاپرولاکتام) که با روش میکروامولسیون سنتز شده است یک ماده حساس به دما است. SPION/پلی(N-ایزوپروپیل اکریل آمید) عامل‌دار شده با گروه آمین به شکل میکروژل می‌تواند پلی‌فنول (کارسیومین) را بخوبی در خود جا دهد و آن را تحت میدان مغناطیسی آزاد کند. پلیمرهای با پایه پلی(N-ایزوپروپیل اکریل‌آمید) به دما حساس هستند و دمای هم‌آمیز پایینی در 32 درجه سانتی‌گراد دارند. یک نانوژل پلیمری و حساس به سه عامل (دما/pH/ردوکس) یعنی نانوذرات P(N-ایزوپروپیل اکریل آمید- N⁰، N-دی‌متیل‌آمینواتیل متاکریلات) و N⁰،N-بیس(اکریلویل)سیستامین (PND-BAC) بعنوان یک نانوحامل دارویی موثر برای آزادسازی DOX استفاده شده است.

پلیمریزاسیون امولسیونی بدون سورفکتانت بعنوان یک روش جذاب برای ساخت میکروکره‌های کلوئیدی شناخته می‌شود. استایرن با داشتن خصوصیات کاربردی زیاد برای تهیه میکروکره‌های دارای پراکندگی تک‌فازی استفاده شده است. لاتکس‌های با ابعاد زیر میکرون و دارای خاصیت ابرپارامغناطیسی با استفاده از استایرن و دی‌ وینیل بنزن بعنوان عامل ایجاد پیوند عرضی تهیه شده‌اند. اکریلیک اسید فعالیت پلیمریزاسیون بالایی در آب دارد و هرگاه با استایرن کوپلیمریزاسیون شود، ذراتی با ابعاد زیرمیکرون و دارای پراکندگی تک فازی تولید می‌شود. استفاده از نسبت مولی بالاتر اکریلیک اسید در مقایسه با استایرن می‌تواند اندازه ذرات را کنترل کند. ذرات بدست آمده از این فرایند (استفاده از استایرن/اکریلیک اسید) پایداری کلوئیدی خوبی در محلول‌های شور از خود نشان می‌دهند و سطح آبگریزی دارند که ناشی از ماهیت آبدوست گروه کربوکسیلیک موجود روی اکریلیک اسید است. این پژوهش نشان می‌دهد که شاخص پراکندگی ذرات سنتز شده به یک نزدیک است که به معنی توزیع یکنواخت ذرات با ابعاد زیرمیکرون است. هم‌چنین بدون در نظر گرفتن شاخص پراکندگی معلوم شد که اندازه ذره لاتکس استایرن/اکریلیک اسید با غلظت اکریلیک اسید در محیط پلیمریزاسیون نسبت عکس دارد.

در این پژوهش سعی داریم تا پتانسیل استفاده از ذرات لاتکس پلی(استایرن-اکریلیک اسید) [P(St/AA)] برای درمان سلول‌های سرطان روده بزرگ و دهانه رحم را با مطالعه پارامترهای مختلف بررسی کنیم. این ذرات لاتکس در این پژوهش سعی داریم تا پتانسیل استفاده از ذرات لاتکس پلی(استایرن-اکریلیک اسید) [P(St/AA)] برای درمان سلول‌های سرطان روده بزرگ و دهانه رحم را با مطالعه پارامترهای مختلف بررسی کنیم. این ذرات لاتکس P(St/AA) عاری از سورفکتانت به کمک یک روش خاص یعنی پلیمریزاسیون امولسیونی عاری از سورفکتانت در حضور یک آغازگر آنیونی (پتاسیم پرسولفات) سنتز شدند.

مواد و روش‌‌ها

مونومر استایرن (St، وزن مولکولی 104/15 g/mol)، اکریلیک اسید بدون آب (AA، وزن مولکولی 72/06 g/mol) و پتاسیم پرسولفات (KPS، وزن مولکولی g/mol 270/322) از شرکت فلوکا (Fisher Scientific، Illkrich، فرانسه) خریداری شدند. این مونومرها قبل از ذخیره شدن در دمای 20 درجه سانتی‌گراد توسط تقطیر تحت فشار پایین خالص‌سازی شدند. KPS، سدیم کلرید (NaCl، شرکت مرک، آلمان)، سدیم هیدروکسید (NaOH، شرکت VWR,BDH, Prolabo) و هیدروکلریک اسید (HCl، شرکت VWR, BDH, Prolabo) به محض دریافت استفاده شدند. آب دیونیزه شده (milli-Q) در تمامی آزمایش‌ها استفاده شد.

آماده‌سازی ذرات پلی‌استایرن

پلیمریزاسیون امولسیونی و بدون سورفکتانت استایرن و اکریلیک اسید در حضور پتاسیم پرسولفات (KPS) بعنوان آغازگر درون یک ظرف شیشه‌ای مجهز به یک همزن مکانیکی، کندانسور و ورودی/خروجی گاز نیتروژن انجام شد. آب دیونیزه شده (190 گرم) به درون یک ظرف شیشه‌ای مخصوص واکنش به حجم 200 میلی‌لیتر اضافه شد در حالی که آب باقی‌مانده برای حل کردن KPS استفاده شد. پس از تزریق گاز نیتروژن بمدت 1 ساعت در حین همزدن محلول در سرعت rpm350، مونومرهای استایرن (20 گرم) و AA (2 گرم) به ظرف اضافه شدند. دمای پلیمریزاسیون با استفاده از یک حمام آب روی 70 درجه سانتی‌گراد کنترل شد. واکنش با افزودن KPS (0/1 گرم) به ظرف شروع شد که این آغازگر در 10 گرم آب دیونیزه شده حل شده بود. پلیمریزاسیون بمدت 12 ساعت ادامه یافت و درصد تبدیل آن به روش ثقل‌سنجی تعیین شد.

اندازه، توزیع و مورفولوژی ذرات

اندازه ذرات به کمک میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و پراکندگی نور شبه الاستیک (QELS) اندازه‌گیری شد. تست QLES با دستگاه NanoZS انجام شد که از شرکت Malvern بریتانیا تهیه شده بود. اندازه‌گیری‌ها حداقل 4 بار انجام شد و مقادیر بدست آمده برحسب مقادیر میانگین گزارش شدند. آنالیز TEM با استفاده از دستگاه Hitachi S 800 (ساخت شرکت هیتاشی، فرانسه) انجام شد. این تست اطلاعاتی درباره اندازه و توزیع ذرات لاتکس در یک حالت خشک شده ارائه می‌دهد. نمونه‌های استفاده شده برای تست TEM با قرار دادن یک قطره از این دیسپرسیون‌ها روی یک توری و خشک کردن لاتکس در دمای اتاق تهیه شدند. تست SEM نیز با استفاده از میکروسکوپ FEI Quanta 250 FEG (شرکت FEI، هلند) در مرکز فناوری‌های ریزساختاری (CT) دانشگاه لیون (فرانسه) انجام شد. یک قطره دیسپرسیون آبی و رقیق شده از این نانوذرات روی یک گیره فولادی و صاف قرار داده شد و در دمای اتاق خشک گردید. نهایتا نمونه مورد نظر توسط اتم‌پاشی کاتدی و در شرایط خلأ با مس پوشانده شدند. نمونه‌ها در ولتاژ شتاب‌دهنده kV15 با میکروسکوپ SEM بررسی شدند.

بررسی خواص الکتروسینتیکی

تحرک الکتروفورتیک لاتکس‌ها با استفاده از دستگاه NanoZS (شرکت Malvern بریتانیا) اندازه‌گیری شد. این آزمایش‌ها با استفاده از ذرات لاتکس شدیدا رقیق شده در غلظت 10³ M NaCl و در pH داده شده انجام شدند. تحرک الکتروفورتیک یا الکتروفورزی نمونه‌ها برحسب تابعی از pH در دمای 20 درجه سانتی‌گراد تعیین شد. هر عدد با میانگین‌گیری از حداقل سه آزمایش بدست آمد.

کشت سلول‌های سرطانی و درمان آن با نانوذرات

سلول‌های سرطانی روده بزرگ انسان (HCT-116, ATCC® CCL-247^TM)، سلول‌های سرطانی دهه رحم (HELA, ATCC® CCL-2^TM) و سلول‌های فیبروبلاست پوست ختنه انسان (HFF-1, ATCC® CCL-24^TM) در این پژوهش استفاده شدند. سلول‌ها در محیط DMEM کشت شدند که حاوی 1 درصد L-گلوتامین، 10 درصد سروم جنین گاوی (FBS)، 1 درصد پنیسیلین/استرپتومایسین (شرکت HyClone، ایالات متحده آمریکا) بودند و در یک انکوباتور مرطوب (Thermo Scientific، ایالات متحده) با 5 درصد CO₂ در دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. زمانی که سلول‌ها به هم‌آمیزی 80 درصد رسیدند، در پلیت‌های 96 خانه‌ای (1.5 10⁴/well) کشت داده شدند. سپس سلول‌ها با غلظت‌های مختلف (0، 25، 50، 100، 200، 400 گرم بر میلی‌لیتر) از نانوذرات لاتکس پلی(استایرن-اکریلیک اسید) بمدت 24 ساعت عمل‌آوری شدند و نهایتا بمدت 48 ساعت با 5 درصد کربن دی‌اکسید در دمای 37 درجه سانتی‌گراد عمل‌آوری شدند.

تست MTT تست MTT (3-(5، 4-دی‌متیل تیازول-2-yl)-5، 2-دی‌فنیل تترازولیوم برومید) یک تست رنگ‌سنجی است که بعنوان شاخصی از بقای سلول استفاده می‌شود. بقای سلول با اندازه‌گیری توانایی سلول‌های زنده برای تبدیل MTT زرد رنگ (رنگ تترازولیوم) به یک رنگ فرمازان ارغوانی سنجیده می‌شود که بصورت اسپکتروفوتومتری قابل شناسایی است. سلول‌های در حال رشد نمایی HCT-16 و HELA در چگالی اولیه 1.5 10⁴/well به درون پلیت 96 خانه منتقل شدند، با غلظت‌های مختلف (0، 25، 50، 100، 200، 400 گرم بر میلی‌لیتر) از ذرات لاتکس پلی(استایرن-اکریلیک اسید) عمل‌آوری شدند و بمدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد درون یک انکوباتور حاوی 5% دی‌اکسید کربن نگهداری شدند. سپس محیط کشت با دقت از پلیت برداشته شد و سلول‌ها در 20 لیتر MTT (سیگما آلدریچ، ایالات متحده) در غلظت mg/ml 10 در محلول بافر فسفات (PBS) بمدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون شدند. رنگ فرمازان که در سلول‌های زنده کریستالی شده بود توسط 100 لیتر ایزوپروپانول و محلول 04/0 درصد HCl بمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به حالت

محلول درآمد و با یک دستگاه میکروتیتر پلیت ریدر (Tecan Infinite 200 PRO، ژنو، سوئیس) در طول موج 270 نانومتر اندازه‌گیری شد. تکثیر سلول برحسب درصد بقای سلول‌های عمل‌آوری شده نسبت به نمونه کنترل (عمل‌آوری نشده) بیان شد.

بررسی مورفولوژی سلول‌های HCT-116 و HELA عمل‌آوری شده با نانوذرات

تغییرات مورفولوژی سلول‌های HELA و HCT-116 عمل‌آوری شده و سلول‌های نمونه کنترل به کمک یک میکروسکوپ نوری (TS100F Eclipse، نیکون، توکیو، ژاپن) بررسی شد. سلول‌های HCT-116 با غلظت‌های مختلف (0، 25، 50، 100، 200 و 400 گرم بر لیتر) از ذرات لاتکس پلی(استایرن-اکریلیک اسید) عمل‌آوری شدند. این سلول‌ها بمدت 24 و 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و درون یک انکوباتور حاوی 5 درصد کربن دی‌اکسید انکوباسیون شدند. پس از این فرایند، تغییرات مورفولوژیکی نمونه‌ها در زیر یک میکروسکوپ نوری مشاهده شد.

آنالیز آماری

نتایج بدست آمده برحسب میانگین انحراف استاندارد (SD) بیان شدند و داده‌های MTT با تست t و واریانس یک طرفه (ANOVA) آنالیز شدند. اختلاف نتایج در p<0.05 از لحاط آماری قابل توجه در نظر گرفته شد. تمامی آزمایش‌ها (n =3) سه مرتبه انجام شدند.

نتیجه‌گیری‌ها

ذرات حاوی گروه کربوکسیلیک و عاری از سورفکتانت سنتز شدند و خواص فیزیکی شیمیایی آنها بررسی شد. این ذرات بار منفی و پایداری کلوئیدی بالایی داشتند که این خواص به pH انکوباسیون ربطی نداشتند. تأثیر مقدار ذرات روی بقای سلول از طریق انجام تست MMT روی سلول‌های روده بزرگ انسان (HCT-116, ATCC® CCL-247^TM)، سلول‌های سرطان دهانه رحم (HELA, ATCC® CCL-2^TM) و سلول‌های فیبروبلاست پوست ختنه انسان (HFF-1, ATCC® SCRC-1041^TM) بررسی شد. نتایج بدست آمده امیدوارکننده هستند چون نشان می‌دهند که نانوذرات P(St/AA) تهیه شده تأثیر زیادی بر سلول‌های HCT-116 و HELA دارند. نتایج نشان می‌دهد که اگر این نانوذرات با غلظت‌های مناسب بمدت 48 ساعت با سلول‌ها در تماس باشند آنگاه اثرگذاری خوبی روی سلول‌های سرطان روده بزرگ و دهانه دارند. هم‌چنین نتایج نشان داد که این ذرات پلیمری با ابعاد زیرمیکرون دارای دو ویژگی هستند: 1) برای استفاده بعنوان حامل دارویی در غلظت‌های پایین مناسب هستند 2) گزینه آینده‌داری برای درمان یا کشتن سلول‌های سرطانی هستند.

منبع مقاله